下一代測序(NGS)技術(shù)使快速讀取患者DNA中成千上萬的堿基序列成為了可能，NGS的快速崛起為遺傳診斷開啟了一個嶄新的時代。然而，新技術(shù)的發(fā)展也帶來了巨大的挑戰(zhàn)，包括技術(shù)水平、數(shù)據(jù)管理和檢測結(jié)果的解釋與咨詢?nèi)矫鎺淼奶魬?zhàn)。將NGS數(shù)據(jù)應(yīng)用于診斷領(lǐng)域之前，尚且還有很多問題需要解決。
在這種背景下，EuroGentest和歐盟人類遺傳學(xué)會對基于NGS的遺傳病診斷進(jìn)行評估和驗證，并制定了NGS診斷指南。該指南經(jīng)過實驗室遺傳學(xué)家、生物信息學(xué)家、臨床遺傳學(xué)家、企業(yè)界和患者代表及其他人類遺傳領(lǐng)域相關(guān)人員的共同討論，最終由實驗室遺傳學(xué)家和生物信息學(xué)家制定。該指南可做為補(bǔ)充材料，幫助診斷實驗室有效應(yīng)用NGS技術(shù)并指導(dǎo)NGS的資質(zhì)認(rèn)證。
該指南主要針對罕見病和單基因疾病的NGS診斷，主要專注于基因panels的靶向分析、特定的捕獲分析以及從全外顯子測序中提取可用數(shù)據(jù)。理論上或許很快就能從全基因組測序中提取類似的信息，在這種情況下，該指南將仍適用，但由于全基因組測序還能檢測到其他疾病的分子特性，因此測序深度應(yīng)當(dāng)相應(yīng)延長。該指南涵蓋了過去幾年關(guān)于NGS的指導(dǎo)方針，但比舊版多了一些新見解，其中最重要的新特性是NGS診斷測試的“評價系統(tǒng)”。
該指南在三次NGS與診斷的重大討論會中生成。第一次研討會于2013年2月25日-26日在比利Leuven舉行，2013年3月7-8日在EuroGentest科學(xué)大會上NGS指南初步意見形成;第二次討論會于2013年10月1日-2日在Leuven舉行，主要對NGS診斷指南進(jìn)行編寫，2013年11月21日-22日在Nijmegen敲定該指南;第三次討論會中，邀請了更多的相關(guān)人員參與，他們被邀請對指南進(jìn)行評論并作評述報告，指南出版前遞交歐洲人類遺傳學(xué)董事會審核，最終該指南于2015年7月正式通過審批并刊出，并獲得了基因診斷聯(lián)盟的高度稱贊，對歐洲NGS診斷產(chǎn)業(yè)的質(zhì)量監(jiān)督有重要意義。
該指南從目前發(fā)展水平、診斷/臨床的效用、知情同意書及對患者和醫(yī)生的通知、驗證、報告、研究與診斷之間的區(qū)別六個方向做了38個聲明，并發(fā)表于《歐洲人類遺傳學(xué)雜志》上。
一、目前發(fā)展水平
從某種意義上說，由于技術(shù)發(fā)展迅猛導(dǎo)致了NGS平臺出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)狀。然而，這不能作為阻止NGS應(yīng)用于診斷領(lǐng)域的理由，因為NGS給患者帶來了潛在的利益。阻止NGS過早用于診斷的原因只能是其質(zhì)量差，未通過驗證就進(jìn)入臨床診斷對患者而言具有威脅性，同時也是不可接受的。
聲明1：未根據(jù)最新指南要求進(jìn)行可接受性驗證測試，NGS不應(yīng)進(jìn)入臨床實踐中。
診斷測試的目的是排除還是確認(rèn)診斷應(yīng)事先定義好，因為排除和確診的區(qū)別很重要，這種區(qū)別主要取決于測試的完整性和授權(quán)性，不僅僅涉及測試技術(shù)的不同設(shè)置還包括診斷的不同意見。
聲明2：實驗室必須確定即將進(jìn)行的測試是用于排除診斷還是證實診斷。
二、診斷/臨床的效應(yīng)
NGS應(yīng)用于診斷領(lǐng)域最大的優(yōu)勢是可在相對短的時間內(nèi)和相對低的成本下檢測多個基因，從而得出更多的分子診斷信息。NGS的局限性在于其對平臺及濃縮方法的依賴，且一直以來認(rèn)為濃縮方法和測序平臺容易受影響，因而額外的測試對高質(zhì)量診斷來說很重要。
聲明3：測試或分析的目的和實用性必須在驗證起始時進(jìn)行討論，且驗證報告中應(yīng)包括摘要總結(jié)。
診斷的效率必須明確，因為致病變異的概率被標(biāo)識了才能做出相應(yīng)的分子診斷。這個概率值由病人群為單位進(jìn)行計算，從臨床角度確定了NGS的性能，是反應(yīng)測試效率和臨床應(yīng)用的很好指標(biāo)。
聲明4：當(dāng)診斷實驗室考慮引進(jìn)NGS監(jiān)測時，首先必須考慮它的診斷效率。
在實踐中，診斷實驗室將提供更好的基因panels，在開發(fā)診斷測試時必須確定將一個基因移植到panels上所需的條件。在理想情況下，該問題應(yīng)以多學(xué)科的方式進(jìn)行一級處理，目標(biāo)是編譯用于診斷的基因列表。
聲明5：出于診斷目的，只有異?；蛐秃团c病理相關(guān)的已知基因(發(fā)表或證實過的)才能納入分析中。
一直以來人們都將與身理缺陷相關(guān)基因稱為“核心基因”，從Sanger技術(shù)發(fā)展NGS技術(shù)，測序的靈敏度不應(yīng)降低。例如BRCA1和BRAC2基因，Sanger測序技術(shù)結(jié)合缺失/重復(fù)分析可使靈敏度達(dá)99%，以此類推該方法對其他基因的診斷效率也應(yīng)該很高。理論上增加其他基因的檢測會增加診斷率，但不應(yīng)以犧牲原有的突變檢測為代價。檢出率的提高是決定核心基因檢測列表和處理缺口的關(guān)鍵因素。
聲明6：出于比對，為了避免不負(fù)責(zé)任的測試，為了患者的利益，“核心疾病基因列表”應(yīng)由臨床和實驗室專家制定。
若不考慮本指南，實驗室可用不同參數(shù)的NGS檢測(技術(shù)和診斷)。事實上，有太多的變量無法通過固定的指南來指導(dǎo)檢測。因此我們?yōu)镹GS檢測提出一個簡單的評分系統(tǒng)，該系統(tǒng)可公平打分并對不同實驗室提供的NGS檢測進(jìn)行簡單比對。
A類檢測：實驗室保證編碼區(qū)和內(nèi)含子區(qū)序列的可靠內(nèi)參或識別變體大于99%，并用Sangger測序(或其他互補(bǔ)的測序分析)進(jìn)行缺口填補(bǔ)，根據(jù)所使用的平臺，選擇額外的分析，如進(jìn)行均聚物延伸的分析。
B類檢測：實驗室能正確描述哪些區(qū)域能在可靠內(nèi)參或識別變體大于99%的條件下測序，并用Sangger(或其他)測序方法進(jìn)行缺口填補(bǔ)。
C類測試：C類測試僅僅基于NGS的試驗，沒有額外的Sangger(或其他)測序試驗。
聲明7：簡單的評分系統(tǒng)基于檢測覆蓋面和診斷率，可對不同實驗室提供的檢測進(jìn)行比較。
三、知情同意書及對患者和醫(yī)生的通知
基于NGS的診斷取決于實驗室所用的程序、平臺、數(shù)據(jù)過濾和數(shù)據(jù)儲存。至關(guān)重要的是，咨詢醫(yī)生應(yīng)當(dāng)被完全告知檢測的局限性及檢測可能出現(xiàn)的不良影響。
聲明8：實驗室提供的每個NGS檢測應(yīng)明確以下幾點：明確目標(biāo)疾病，明確所檢測的基因名稱，明確可報告范圍，明確分析敏感度和特異性，如果可以，還應(yīng)明確與臨床表型無關(guān)但與所檢測的基因相關(guān)的疾病。
NGS診斷的應(yīng)用性主要依賴于直觀結(jié)果和二次結(jié)果。盡管直觀結(jié)果可從與檢測疾病相關(guān)的基因信息中獲得，但二次結(jié)果卻隱藏在與檢測疾病無關(guān)的疾病基因中。
聲明9：診斷實驗室的分析途徑應(yīng)聚焦于處于調(diào)查研究中的基因pannel以避免二次結(jié)果的發(fā)生，并進(jìn)行相應(yīng)的驗證。
直觀結(jié)果在基因pannel中的概率很低，一般依賴于疾病基因。然而，檢測結(jié)果還有可能反映出隱性雜合突變，根據(jù)此還可判斷疾病的攜帶狀況。這將對后續(xù)的咨詢、生育選擇等產(chǎn)生影響。
聲明10：實驗室應(yīng)該提供直觀結(jié)果的信息。
在執(zhí)行NGS診斷檢測之前，臨床(遺傳)中心需要建立一個“直觀結(jié)果和二次結(jié)果的協(xié)議”，該協(xié)議必須與倫理委員會的意見相符，應(yīng)明確——在實驗室、研究所或國家層面上——除了最初的診斷結(jié)果，患者對檢測出來的額外結(jié)果的告知是否有選擇決定權(quán)，還應(yīng)詳細(xì)說明檢測直觀結(jié)果與疾病攜帶狀況是否出現(xiàn)在檢測報告中。實驗室必須確保能妥善管理協(xié)議中的每一條選項。
聲明11：關(guān)于與目標(biāo)疾病無關(guān)的其他疾病攜帶狀態(tài)和二次結(jié)果是否被告知的選項協(xié)議，如果臨床中心或?qū)嶒炇覜Q定為患者提供，那么該協(xié)議應(yīng)該包含所有的邏輯性。
此外，檢測前遺傳咨詢是必要的，且應(yīng)包括預(yù)期結(jié)果和潛在的直觀結(jié)果與二次結(jié)果的討論，并提供足夠的信息。
聲明12：應(yīng)讓患者清楚當(dāng)?shù)貙χ庇^結(jié)果與二次結(jié)果的管理政策。
聲明13：建議給患者提供一份書面說明書或在線可用信息說明。
四、驗證
樣品的質(zhì)量與許多參數(shù)有關(guān)，包括數(shù)據(jù)的產(chǎn)量、PCR拷貝和覆蓋的比例。在診斷設(shè)置中，只有好的樣本才是必須分析的，因此對高質(zhì)量的目標(biāo)基因pannel、外顯子或基因組的標(biāo)準(zhǔn)定義十分必要。
聲明14：應(yīng)準(zhǔn)確描述診斷程序中所有的NGS質(zhì)量測量指標(biāo)。
NGS技術(shù)要求監(jiān)測特定的run和特定分析/樣本的特性。監(jiān)測數(shù)據(jù)無需做成報告但可用于后續(xù)的驗證。
聲明15：診斷實驗室應(yīng)對平臺、所有的分析和所有的樣本設(shè)置一個相關(guān)質(zhì)量度量結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)庫。
由于NGS工作流程非常復(fù)雜，因此應(yīng)建立樣本的追蹤方法，包括在實驗室和計算分析中實施并聯(lián)法。
聲明16：在評估分析處理中包括平臺驗證過程應(yīng)建立樣本追蹤方法和設(shè)置樣本識別條形碼。
在平臺驗證過程中，實驗室必須確保所有的設(shè)備和試劑都與制造商的要求相符。必須明確每種技術(shù)的局限性，并在開發(fā)測試和數(shù)據(jù)分析中將其考慮在內(nèi)。實驗室必須能區(qū)分附屬于平臺、特殊檢測或分析流程的特性。
聲明17：平臺驗證應(yīng)包括精準(zhǔn)度和精密度，且通過驗證的平臺工作結(jié)果無需其他方法來重復(fù)驗證。
顯然每種測序技術(shù)都存在著優(yōu)缺點，生物信息學(xué)工具必須能反映這些特征。
聲明18：生物信息學(xué)流程必須針對所使用的技術(shù)平臺。
在流程的驗證期間，診斷規(guī)范必須通過敏感和特性的分析評估。例如，SNP檢測最佳化的算法對(小片段)插入/刪除的檢測準(zhǔn)確性不高。實驗室必須證實意識到這些特性以及所使用的變異檢測流程能滿足當(dāng)前診斷分析。
聲明19：在不同的流程驗證中，必須為每種類型的變異建立敏感性和特異性分析。
任何化學(xué)成分的改變、濃縮方法或生物信息學(xué)分析平臺應(yīng)該保證后續(xù)的有效性。
聲明20：診斷實驗室必須驗證所有的生物信息學(xué)流程(公用工具或商業(yè)軟件包)的標(biāo)準(zhǔn)信息設(shè)置，以確保相關(guān)數(shù)據(jù)更改后(新版本)及時跟進(jìn)。
包含所有相關(guān)變異的本地數(shù)據(jù)庫提供了識別特定工作平臺的工件、跟蹤驗證結(jié)果、提供特異性位點數(shù)據(jù)和meta-分析交換代理(exchange proxy)的重要工具。通常這個數(shù)據(jù)庫應(yīng)允許進(jìn)一步注釋(假陽性、已知突變、隔離變體等)，這將大大簡化診斷過程。
聲明21：診斷實驗室應(yīng)使用當(dāng)前注釋相關(guān)變異體的結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)庫。
數(shù)據(jù)存儲應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)的開放性格式如FASTQ、BAM或VCF，這些格式的數(shù)據(jù)可與其他實驗室共享。當(dāng)存儲分析結(jié)果時，應(yīng)額外保存完整的日志文件。日志文件應(yīng)盡可能完整以保證FASTQ數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為整個診斷報告的可復(fù)寫性。遺憾的是，關(guān)于如何存儲目前國際上還沒有共識。然而，存儲必須符合國家的需求和常識。
聲明22：診斷試驗必須對所有相關(guān)數(shù)據(jù)的長期存儲采取相應(yīng)措施。
在啟動任何試驗之前，必須確定好臨床目標(biāo)(包括編碼區(qū)和保守的剪接位點)，臨床目標(biāo)取決于診斷測試與所定義的基因pannel。
聲明23：可報告范圍必須在測試開發(fā)過程中確定，且對臨床醫(yī)生具有可用性(報告或傳達(dá)數(shù)字)。
聲明24：“可報告范圍”的要求取決于診斷分析的目的。
例如，外顯子測序分析的目的是獲得高效率的診斷，不需要進(jìn)行額外分析來獲取所有基因組所覆蓋的信息，但需要與臨床醫(yī)生清晰溝通這種測試方法不能用于排除特定的臨床診斷。診斷測試必須進(jìn)行準(zhǔn)確性、靈敏性和特異性的分析評估。原則上，這些評估并不是新穎的，且被認(rèn)為很麻煩，但I(xiàn)SO標(biāo)準(zhǔn)對其的要求十分嚴(yán)格。
聲明25：當(dāng)測試發(fā)生重大變化時，必須對質(zhì)量參數(shù)進(jìn)行檢查，且必須重新上樣檢測。實驗室應(yīng)事先定義好當(dāng)測試方法更新或升級后哪種類型的樣本要重新分析及分析次數(shù)。
五、報告
NGS檢測結(jié)果報告的清晰性和一致性至關(guān)重要，因為實驗室的報告可能被專家和非專家閱讀。從實用的角度來看，臨床上的重要結(jié)論、相關(guān)測試和測試質(zhì)量數(shù)據(jù)應(yīng)寫在報告的首頁。
聲明26：NGS的分析報告應(yīng)該對患者的鑒別診斷進(jìn)行總結(jié)，簡要描述測試，總結(jié)結(jié)果，將主要結(jié)果放于報告首頁。
所有致病(5類)或可能致病(4類)的變異必須包含在報告中，由當(dāng)?shù)卣邲Q定是否報告未分類的變異(UVs-3類)，且實驗室科學(xué)家及臨床醫(yī)生必須清楚UVs-3類。
聲明27：關(guān)于基因變異報告的當(dāng)?shù)卣?符合國際建議)應(yīng)由實驗室在分析之前建立和制定。
聲明28：必須收集UVs數(shù)據(jù)，最終目的是將這些變異體進(jìn)行分類。
需發(fā)起收集和分享可用信息的群體活動，最終目的是將變異體絕對分類為致病性(5類)或良性(1類)。被實驗室或研究所采納的與直接結(jié)果和二次結(jié)果相關(guān)的政策必須體現(xiàn)在實驗室的實踐和報告中。
聲明29：在啟動檢測之前，實驗室應(yīng)有一個關(guān)于訪問直接結(jié)果和二次結(jié)果的明確協(xié)議。
診斷實驗室不應(yīng)該因舊數(shù)據(jù)的分析請求而超載。診斷請求應(yīng)是包含合適時間與合適地點的合同，診斷試驗只能在給定的時間提供已知的和經(jīng)過驗證的信息。
聲明30：一般情況下實驗室不會系統(tǒng)性地重分析舊數(shù)據(jù)并生成新報告，即使與疾病相關(guān)的核心基因發(fā)生了變化。
但在特殊情形下(該情形由疾病的實驗室或社區(qū)專家決定，如變體類型發(fā)生變化時)，實驗室有責(zé)任重新分析數(shù)據(jù)，在新證據(jù)的基礎(chǔ)上生成新報告，并重新聯(lián)系相關(guān)臨床醫(yī)生和患者，告知變異新狀態(tài)可能帶來的影響，這種情況下，建立病人與變異體的有效連接系統(tǒng)十分有必要，該系統(tǒng)在變異體重新分類時可對受影響病例進(jìn)行檢索。
聲明31：為了管理疾病變異體，實驗室必須建立本地變量數(shù)據(jù)庫，為不同疾病的檢測提供臨床依據(jù)。
六、研究和診斷之間的區(qū)別
隨著全基因組測序在研究和診斷領(lǐng)域的可能性增加，兩者之間的界線也越來越模糊，因此描述對患者診斷數(shù)據(jù)的用途以及確定特定類型的分析研究是必要的。然而，這并不排除對診斷結(jié)果進(jìn)一步研究的建議，但研究與診斷之間的區(qū)別必須時刻保持清晰。
聲明32：任何診斷測試都是為了回答與患者醫(yī)療條件相關(guān)的臨床問題。
聲明33：研究測試是一種驅(qū)動假設(shè)，結(jié)果可能僅限于參與研究的患者的臨床效應(yīng)。
聲明34：通過分析外顯子或基因組得出的診斷測試結(jié)果可假設(shè)生成。
在診斷過程中，使用NGS技術(shù)獲得的外顯子測序和基因組數(shù)據(jù)是可以接受的，如果目標(biāo)是獲得一個遺傳診斷那么檢測將局限于與該疾病相關(guān)的已知基因。
聲明35：當(dāng)以單一患者的診斷為的目的診斷檢測應(yīng)在獲認(rèn)可的實驗室中進(jìn)行。
當(dāng)參與一個研究項目時，患者及其家庭必須意識到這個項目可能會披露其遺傳性疾病的信息。在研究中，臨床相關(guān)的結(jié)果必須在診斷確定后才能納入患者的醫(yī)療記錄中。
聲明36：研究結(jié)果必須在通過認(rèn)證的實驗室確定后方可轉(zhuǎn)移至患者身上。
大多數(shù)實驗室都建立本地測序/分析樣本變異頻率數(shù)據(jù)庫以便易于進(jìn)行變異解釋。這類數(shù)據(jù)庫不包含任何敏感的信息。出于隱私原則考慮，不掂量這些數(shù)據(jù)對診斷和醫(yī)療改善的重要性。
聲明37：所有來自健康個體的診斷測試或研究測試的變異頻率都應(yīng)共享。
理想情況下，疾病檢測中所有與基因相關(guān)的變體應(yīng)該提交至致病性變異數(shù)據(jù)庫，并與患者的臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合。用于變異體分類的標(biāo)準(zhǔn)和參數(shù)應(yīng)清楚描述。
